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一種基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010191095.1

申請日:

20100603

公開號:

CN101864433A

公開日:

20101020

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:

IPC分類號:

C12N15/31,C12N15/81,C12N1/19,C12N1/38,C12N1/20,C07K14/305,C07K1/18,C12R1/84,C12R1/32,C12R1/34

主分類號:

C12N15/31,C12N15/81,C12N1/19,C12N1/38,C12N1/20,C07K14/305,C07K1/18,C12R1/84,C12R1/32,C12R1/34

申請人:

中國人民解放軍第四軍醫大學

發明人:

師長宏,張海,李倫,趙勇

地址:

710032 陜西省西安市長樂西路17號

優先權:

CN201010191095A

專利代理機構:

西安通大專利代理有限責任公司

代理人:

陸萬壽

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內容摘要

本發明公開了一種基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法及其應用,在構建外源性表達載體pPIC-Rpf的基礎上,將其轉化畢赤酵母制備重組子,經過抗性篩選得到分泌Rpf蛋白的畢赤酵母重組子。該畢赤酵母表達系統能夠持續分泌具有生物活性的Rpf蛋白,該蛋白能夠促進恥垢分枝桿菌休眠菌的復蘇和結核分枝桿菌H37Ra的生長,促進臨床TB病人痰標本中MTB的生長,可用于臨床TB的快速診斷。

權利要求書

1.一種基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:1)以包含Rpf基因的載體或基因組為模板,以引物對P為引物,PCR擴增Rpf基因;所述的引物對P為:上游引物P1:gcctcgagaa?acgagaggct?gacaccatga?ctctcttcac??40;下游引物P2:tagcggccgc?tcaggcctga?ggcaggacga?gctcc???????35;2)將PCR擴增的Rpf基因用XhoI和NotI雙酶切得到線性化片段;并將該線性化片段與被XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接得到重組酵母表達載體pPIC-Rpf;將重組酵母表達載體pPIC-Rpf轉化到感受態的畢赤酵母,篩選得到整合了目的基因的陽性轉化子;3)將陽性轉化子在BMGY培養基中30℃、200r/min條件下培養,當OD600達到2.0~6.0時,離心收集菌體,用BMMY培養基重懸進行誘導表達,每24h補加甲醇至終濃度為0.5%,30℃、200r/min條件下繼續培養96~120h后收集培養上清液;4)將收集的培養上清液通過層析分離純化得到Rpf因子。2.如權利要求1所述的基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法,其特征在于,重組酵母表達載體pPIC-Rpf包含如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。3.如權利要求1所述的基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法,其特征在于,重組酵母表達載體pPIC-Rpf轉染感受態畢赤酵母為:將酶切線性化的重組酵母表達載體pPIC-Rpf與感受態畢赤酵母混合后,滴加于0.1cm電轉杯中,冰水浴5min,在電壓1800V、電容25uF、電阻200Ω條件下電擊轉化;電擊后,立即加入1ml濃度為1M預冷的山梨醇,混勻,30℃條件下靜置2h,涂布于MD平板,30℃培養2~3天,直至出現菌落。4.如權利要求1所述的基于轉化體的分泌型Rpf因子的制備方法,其特征在于,所述的培養上清液通過凝膠層析分離純化為:將收集的培養上清液濃縮后洗脫除鹽,收集包含Rpf因子主峰的粗純化洗脫液;將收集的粗純化洗脫液經濃縮、透析后上樣于陰離子交換層析柱,用含0~1mol/L?NaCl的pH?8.0、20mmol/L?Tris-HCl洗脫分離,收集包含純化Rpf因子主峰的洗脫液。5.一種轉化體,其特征在于,該轉化體的宿主細胞為畢赤酵母Pichia?pastoris?SMD1168,轉染宿主細胞的外源性表達載體是包含Rpf基因的重組酵母表達載體pPIC-Rpf。6.如權利要求5所述的轉化體,其特征在于,所述的重組酵母表達載體pPIC-Rpf是以包含Rpf基因的載體為模板,以引物對P為引物,PCR擴增Rpf基因,然后將Rpf基因用XhoI和NotI雙酶切得到線性化的片段,并將該線性化片段與XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接而得到。7.分泌型的Rpf因子應用于結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的復蘇和促生長。8.如權利要求7所述的應用,其特征在于,所述的結核分枝桿菌是臨床痰標本中的結核分枝桿菌。9.如權利要求7所述的應用,其特征在于,分泌型的Rpf因子的濃度為10~1000pM。10.分泌型的Rpf因子應用于恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)和結核休眠菌的復蘇與促生長。

說明書

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技術領域

本發明屬于醫藥生物技術領域,涉及細菌復活促進因子(Rpf因子)的表達與純化,特別涉及一種基于轉化體的分泌型Rpf蛋白的制備方法及其應用。

背景技術

1、Rpf因子的功能與結構

Rpf(Resuscitation-promoting?factor,Rpf)是一種細菌復活促進因子,其功能類似于真核生物的生長因子,可以在皮克(10-12)水平以自分泌和旁分泌形式促進休眠菌的復活和生長,所以被稱為細菌的生長因子。該因子最初是在藤黃微球菌(M.luteus)中發現,Rpf因子除能促使休眠菌復活和生長以外,對正常生長的細菌也有相應的效果;其機制可能是參與了細胞間的信號轉導。目前已查明了Rpf氨基酸順序并確定了編碼這種蛋白的基因,相似的Rpf基因廣泛分布在高G+C%含量的革蘭氏陽性菌中。

藤黃微球菌Rpf蛋白理論上是一個分子量為19kD的蛋白質,氨基端是由75個氨基酸殘基組成的保守區,三級結構具有溶菌酶樣折疊,形成一個能與寡聚糖結合的裂隙,在第54位有一個非常保守的谷氨酸殘基,推測其有催化功能。保守區氨基酸序列與結核分枝桿菌Rpf樣蛋白相似(75%的氨基酸殘基相同);羧基端是可變區,由109個氨基酸殘基組成,包括與細胞壁肽聚糖結合的LysM結構域,該區域有結合細胞壁的能力;兩個結構域由較短的連接區連接。Viktoria等研究琥珀中分離的藤黃微球菌發現:它的Rpf的保守區和可變區與實驗室保存菌株區別不大,但連接區區別較大,保存菌株的連接區只有10個氨基酸而分離菌有120個氨基酸之多,推測可能是環境適應的結果;分離菌另一個特點是Rpf結合到細胞壁上,而不釋放到周圍環境,分離菌抗溶菌酶能力也比保存菌強。

Mukamolova等通過實驗證明了藤黃微球菌Rpf蛋白具有胞壁溶解活性:當表達并分泌到細胞質中能夠引起大腸埃希氏菌裂解;能夠從熒光胺標記的細胞壁上釋放熒光;能水解人工合成的溶菌酶底物;能水解藤黃微球菌細胞壁粗提物;使含有細胞壁粗提物的聚丙烯酰胺凝膠形成透明圈。他們測定的Rpf溶菌活性只有溶菌酶的五十分之一,另外,藤黃微球菌Rpf還有弱的胰蛋白酶樣活性;當改變Rpf多肽鏈的第54位的谷氨酸時,其水解肽聚糖的活性降低。

大腸桿菌表達體系中獲得的Rpf往往以包涵體形式存在,純化過程必須先變性再復性才能得到該蛋白,這樣劇烈的條件難以保證Rpf的生物活性。畢赤酵母表達系統是近年發展起來的高效分泌表達系統,可對目的蛋白進行翻譯后修飾。該表達系統不含有特異性的病毒,不產生毒素,基因工程操作簡便,大規模發酵工藝簡單,成本低廉。畢赤酵母表達系統的另一優越性就是系統表達產物直接分泌到培養基中,不需復雜的破菌過程,且上清中雜蛋白含量很低,這不但使目的蛋白易于純化,同時也有益于保持目的蛋白的生物學活性。目前已有200多種重組蛋白在該系統中表達。

2、結核病臨床診斷中存在的問題

目前我國常規的TB診斷方法仍是結核菌素試驗結合抗酸染色和分離培養。結核菌素試驗結合抗酸染色的方法準確率較高,但漏檢率亦高,其主要原因是人群普遍接種BCG后,結核菌素試驗的診斷價值已大大降低,常用的涂片染色鏡檢法是抗酸染色法,屬低敏感性方法,陽性率不到40%。另外,抗酸性是分枝桿菌屬的特征,并非結核菌種的特性。因此,涂片染色鏡檢陽性時,應僅報告抗酸桿菌陽性,但臨床上往往是將“抗酸桿菌陽性”等同于“結核菌陽性”,這實際上是臨床醫生結合其它有關的臨床資料的綜合診斷,并非細菌學的認定。有報道指出,臨床診斷為TB的細菌分離株中,經鑒定后發現有2%~5%為非結核分枝桿菌。分離培養的檢出率也很低,尤其對于持留菌、休眠菌及代謝異質菌無法成功培養。

國內外近年來嘗試建立了幾種新的診斷方法,如通過檢測抗MTB抗體或通過PCR法檢測MTB的核酸等來輔助診斷結核病,這些方法的敏感性較前述方法高,但檢出率一般也僅在70%左右,而且假陽性率亦較高。同時由于耐藥菌株的大量出現,治療需要藥物敏感實驗的指導,雖然利用基因芯片、單鏈構象多態性等方法可以進行快速耐藥菌株鑒定,但由于一些引起耐藥的基因突變位點尚不清楚、一些突變位點為無意義突變、新抗生素使用等,使其敏感性不足80%,且試驗結果必須用表型方法驗證。所以常規藥物敏感實驗仍是臨床上最常采用的方法。

目前國內尚無適用于臨床TB病人的簡便、敏感、特異的檢驗方法。一些新的檢驗方法雖然敏感性提高,但特異性下降,同時這些方法多針對結核分枝桿菌的,因此僅適用于開放性活動性結核,而不適用于非開放感染。目前MTB感染診斷的金標準仍是細菌培養和痰涂片直接鏡檢。分離培養是較敏感的方法,可檢出菌量為100菌落形成單位/毫升(cfu/mL)的細菌,MTB的培養檢查常常作為TB診斷的參照方法或金標準。

因此,無論是要進行TB診斷還是有關的藥物敏感實驗,都首先要分離到MTB。臨床檢驗上常規MTB的分離培養存在的主要問題是敏感性低和所需時間太長。MTB生長緩慢,普通細菌約20分鐘分裂一次,MTB則需20小時才繁殖一代,MTB培養要4~6周時間,很多臨床分離株、特別是耐藥株原代培養結束、觀察報告最后為陰性結果的時間延長到8周。所以,有必要建立MTB簡便、快速、特異性高的檢測方法,尤其是縮短檢出時間和提高敏感性。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種分泌型Rpf因子的制備方法及其應用,通過構建畢赤酵母表達系統制備分泌型的Rpf因子,該蛋白能夠促進恥垢分枝桿菌休眠菌的復蘇和MTB減毒株H37Ra的生長,能夠促進臨床TB病人痰標本中MTB的生長,縮短臨床TB診斷的時間。

本發明是通過以下技術方案來實現:

一種基于酵母表達系統的分泌型Rpf因子的制備方法,包括以下步驟:

1)以藤黃微球菌(M,luteus)基因組為模板,以引物對P為引物,PCR擴增Rpf基因;所述的引物對P為:

上游引物P1:gcctcgagaa?acgagaggct?gacaccatga?ctctcttcac????;

下游引物P2:tagcggccgc?tcaggcctga?ggcaggacga?gctcc?????????;

2)將PCR擴增的Rpf基因用XhoI和NotI雙酶切得到線性化的片段;并將該線性化片段與被XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接得到重組酵母表達載體pPIC-Rpf;將重組酵母表達載體pPIC-Rpf轉化到感受態的畢赤酵母,篩選得到整合了目的基因的陽性轉化子;

3)將陽性轉化子在BMGY培養基中30℃、200r/min條件下培養,當OD600達到2.0~6.0時,離心收集菌體,用BMMY培養基重懸進行誘導表達,每24h補加甲醇至終濃度為0.5%,30℃、200r/min條件下繼續培養96~120h后收集培養上清液;

4)將收集的培養上清液通過層析分離純化得到Rpf因子。

所述的重組酵母表達載體pPIC-Rpf包含有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

重組酵母表達載體pPIC-Rpf轉染感受態畢赤酵母為:

將酶切線性化的重組酵母表達載體pPIC-Rpf與感受態畢赤酵母混合后,滴加于0.1cm電轉杯中,冰水浴5min,于電壓1800V,電容25uF,電阻200Ω條件下電擊轉化;

電擊后,立即加入1mL濃度為1M預冷的山梨醇,混勻,30℃條件下靜置2h,涂布于MD平板,30℃培養2~3天,直至出現菌落。

所述的培養上清液通過凝膠層析分離純化為:

將收集的培養上清液濃縮后洗脫除鹽,收集包含Rpf因子主峰的粗純化洗脫液;將收集的粗純化洗脫液經濃縮、透析后上樣于陰離子交換層析柱,用含0~1mol/L?NaCl的pH?8.0、20mmol/L?Tris-HCl洗脫分離,收集包含純化Rpf因子主峰的洗脫液。

一種轉化體,宿主細胞為畢赤酵母Pichia?pastoris?SMD1168,轉染宿主細胞的外源性表達載體是包含Rpf基因的重組酵母表達載體pPIC-Rpf。

所述的重組酵母表達載體pPIC-Rpf是以包含Rpf基因的載體為模板,以引物對P為引物,PCR擴增Rpf基因,然后將Rpf基因用XhoI和NotI雙酶切得到線性化的片段,并將該線性化片段與XhoI和NotI雙酶切的pPIC9K載體片段連接而得到。

分泌型的Rpf因子應用于結核分枝桿菌(M.?tuberculosis)的復蘇和促生長。

所述的結核分枝桿菌是臨床痰標本中的結核分枝桿菌。

分泌型的Rpf因子的濃度為10~1000pM。

分泌型的Rpf因子應用于恥垢分枝桿菌休眠菌的復蘇和結核減毒株H37Ra的促生長。

與現有技術相比,本發明具有以下有益的技術效果:

1、本發明通過構建包含Rpf因子的畢赤酵母表達體系,成功表達出分泌型Rpf因子;該Rpf因子能夠在pM水平促進結核減毒株的生長。

在已完成的40例病人痰標本中,當培養基中加入Rpf因子后其培養時間比常規方法平均縮短一周以上,而且細菌數量明顯增加;Rpf因子對結核減毒株和TB病人痰標本最適作用濃度在100pM范圍內。

本發明提供的分泌型Rpf因子有利于建立結核分枝桿菌快速、敏感的檢測方法,解決結核菌生長緩慢和敏感性低的問題,有利于改進臨床檢驗上常規MTB的分離培養和藥物敏感實驗方法,縮短結核菌檢測所需時間。

2、Rpf因子在大腸桿菌表達體系中往往以包涵體形式存在,純化過程必須先變性再復性才能得到該蛋白,這樣劇烈的條件難以保證Rpf因子的生物活性。本發明通過構建持續分泌Rpf因子的畢赤酵母表達體系,并對表達產物進行了凝膠層析分離純化,整個過程沒有使蛋白變性,保證了Rpf完整的生物活性;

本發明制備的Rpf可以在pM水平促進恥垢休眠菌的復蘇和生長;Rpf對恥垢休眠菌作用的最適濃度在100pM范圍內。

3、利用本發明能夠篩選到高表達的重組酵母菌,重組pPIC-Rpf酵母轉化子表達的Rpf因子約占總分泌蛋白量的35%;目的蛋白的經過兩次凝膠層析能夠分離到純度在90%以上的Rpf因子;

而且將篩選得到的高表達菌株通過5L貝朗發酵罐誘導表達,能夠獲得大量的具有較高生物活性的Rpf因子。

附圖說明

圖1是PCR擴增Rpf基因片段的電泳檢測結果圖;

圖2是pPIC9K載體的質粒圖譜;

圖3是pPIC-Rpf載體經XhoI/NotI雙酶切結果圖;

圖4是pPIC-Rpf載體經PCR擴增鑒定結果圖;

圖5是pPIC-Rpf轉染陽性的酵母轉化子的PCR鑒定結果;

圖6是pPIC-Rpf酵母轉化子培養上清的SDS-PAGE電泳;

圖7是pPIC-Rpf酵母轉化子培養上清的Western-blot分析結果;

圖8是Rpf因子作用下恥垢分枝桿菌的生長曲線;

圖9是Rpf因子作用下MTB?H37Ra的生長曲線;

圖10是痰涂片陽性的TB患者標本在Rpf因子作用下的生長曲線。

具體實施方式

本發明提供一種分泌Rpf因子(Rpf蛋白)的畢赤酵母表達體系,在構建外源性表達載體pPIC-Rpf的基礎上,將其轉化畢赤酵母制備重組子,經過抗性篩選得到分泌Rpf蛋白的畢赤酵母重組子;并對目的基因的表達和Rpf促MTB復蘇和生長的效果進行驗證。下面結合附圖對本發明作進一步的詳細說明,所述是對本發明的解釋而不是限定。

1、Rpf基因的克隆及表達載體pPIC-Rpf的構建

根據GenBank中的Rpf基因序列(NC_012803.1,GeneID:7985360)設計并人工合成引物對P:

上游引物P1:gcctcgagaa?acgagaggct?gacaccatga?ctctcttcac????40;

下游引物P2:tagcggccgc?tcaggcctga?ggcaggacga?gctcc?????????35;

其中,上游引物P1包含XhoI酶切位點(ctcgag)和分泌表達所需的序列,下游引物P2包含NotI酶切位點(gcggccgc)和終止子,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

以藤黃微球菌(M,luteus)基因組為模板(來自第四軍醫大學附屬西京醫院臨床檢驗科)為模板,以引物對P為引物擴增目的基因Rpf。PCR反應條件:94℃預變性3min;94℃30s,55℃40s,72℃50s,共30個循環;再于72℃延伸5min。回收PCR產物后,進行10g/L的瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果如圖1所示,泳道M為Marker,泳道1為擴增的Rpf基因片段,可以看出PCR擴增的Rpf基因片段約為672bp。

將Rpf基因片段克隆入pMD18-T載體,送寶生物工程(大連)有限公司測序,Rpf基因的測序結果如SEQ.ID.NO.1所示,經過比較與GenBank報道的完全一致;將測序正確的載體命名為pMD18-T-Rpf。

將pMD18-T-Rpf質粒經XhoI/NotI雙酶切回收后用連接試劑盒連接入同樣經過XhoI/NotI雙酶切的pPIC9K(Invitrogen.,Catalog?no.V175-20;pPIC9K載體質粒圖譜如圖2所示)載體回收連接后的片段,并電轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。

將轉染后的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素100mg/L的LB平板,37℃培養,在同一平板上隨機篩選4個菌落,分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養液中,37℃振蕩培養過夜,收菌后提取質粒DNA;

將提取的質粒DNA用XhoI和NotI雙酶切,37℃反應兩小時,然后進行10g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果如圖3所示,泳道M為Marker,泳道1~2為陽性克隆提取質粒的雙酶切,可以看到出現了672bp的目的基因片段;

以提取的質粒DNA為模板,以引物對P為引物,按照Rpf基因擴增程序進行PCR擴增,并對PCR擴增產物進行凝膠電泳鑒定,結果如圖4所示,泳道M為Marker,泳道1~2為陽性克隆提取質粒的PCR結果,可以看到出現了672bp的目的基因片段;將構建正確的包含目的基因片段的載體命名為重組酵母表達載體pPIC-Rpf。

2、酵母宿主菌的轉化及陽性轉化子的篩選

畢赤酵母(Pichia?pastoris)基因表達系統是近年來發展起來的一種新型外源基因表達系統,它既具有原核表達系統易于遺傳操作和培養的優點,又具有對重組蛋白進行正確的折疊和翻譯后加工修飾(如糖基化)等特點,而且畢赤酵母自身分泌的蛋白質較少,有利于外源蛋白的分離純化,蛋白表達水平高,適宜高密度培養,且具有分泌型表達的優勢,為工業化生產和純化提供了極大便利。因此,本發明采用畢赤酵母作為宿主細胞。Rpf因子的畢赤酵母高效真核表達系統的建立具體為:

本發明首先將重組酵母表達載體pPIC-Rpf經Sal?I酶切(pPIC9K載體中的一個酶切位點)線性化,并應用乙醇沉淀法濃縮線性化的pPIC-Rpf載體,使之濃度達到1μg/μL;

然后取80μL酵母菌感受態細胞(His營養缺陷株)與10μg線性化的重組酵母表達載體pPIC-Rpf混合,用加樣器將其滴加于0.1cm電轉杯中,冰水浴5min,用Bio-Rad?GeneII電轉儀于電壓1500V,電容25μF,電阻200Ω條件下電轉化,將pPIC-Rpf轉化到Pichiapastoris?SMD1168的基因組中;

電擊后,立即加入1mL濃度為1M冰預冷的山梨醇,混勻,轉移至15mL離心管中,30℃,靜置2h;分別取重組的酵母菌液涂布于MD平板,30℃培養2~3天,直至出現菌落,篩選得到His+重組克隆(由于畢赤酵母菌在組氨酸脫氫酶位點His4有突變,因而不能合成組氨酸,不能在不含組氨酸的MD平板上生長,而pPIC9K載體上含有His4基因可與宿主進行互補,使重組轉化子獲得合成組基酸的能力,通過不含組氨酸的培養基來選擇轉化子)。

將篩選得到His+重組克隆分別涂布于G418濃度逐漸升高(0.25~2.0mg/ml)的YPD(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖)平板上,涂布0.25的濃度后再劃線涂布于更高濃度的平板上,每次涂布30℃培養2~3天,挑取具有G418抗性的菌落,在YPD(含G418)平板上劃線進行純化,篩選得到陽性轉化子,作為誘導表達的候選菌株。

挑取G418抗性的菌落,以P1和P2為引物,PCR檢測G418抗性的菌落中是否含有重組的表達載體,驗證陽性轉化子。PCR擴展產物的電泳結果如圖5所示,泳道M為Marker,泳道1~2為陽性酵母轉化子的PCR結果,可以看到泳道1~2均出現了672bp的目的基因片段。

本發明中外源基因是以整合的方式插到酵母的染色體上,pPIC9K含有卡那霉素抗性基因,在酵母中則抗G418,有文獻報道在大多數情況下外源基因表達量與拷貝數成線性關系,故用其篩選導入酵母的多拷貝的重組質粒。若多拷貝的表達單元整合入酵母基因組中,其對G418的抗性能力就會加強,篩選多拷貝的轉化菌株是期望其分泌的目的蛋白量增加。本發明通過提高培養基中G418的濃度來篩選多拷貝的轉化菌株,最終在4mg/mLG418的平板篩選到工程菌株。

3、目的蛋白的誘導表達與高表達菌株的篩選

將篩選出的酵母轉化子接種于250ml?BMGY培養基(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,100mmol/L磷酸鉀,p?H?6.0,1.34%YNB,4×10-5%生物素,1%甘油)中,30℃、200r/min培養至OD600=2.0~6.0,在室溫下于1500~3000×g離心5min收集菌體;

將收集的菌體用BMMY培養基(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,100mmol/L磷酸鉀,pH?6.0,1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%甘油)懸浮,30℃、200r/min誘導培養(BMMY中含有甲醇,可以啟動AOX1從而誘導蛋白表達),每24h取樣并補加甲醇至終濃度為0.5%,誘導96~120h后收集培養上清液;

不同的重組pPIC-Rpf酵母轉化子培養上清經SDS-PAGE電泳檢測,挑選目的蛋白Rpf因子(20kDa)表達量大的重組轉化子,重組表達的Rpf因子大于總分泌蛋白量的35%作為生產菌株。

重組pPIC-Rpf酵母轉化子培養上清的SDS-PAGE電泳檢測結果如圖6所示,其中,泳道M為蛋白標準分子量Maker,泳道1~2為正常酵母發酵液上清;泳道3為BMMY中的甲醇誘導前發酵液上清;泳道4為BMMY中的甲醇誘導后的發酵液上清;經過對比可以發現,重組轉化子在被誘導表達后,目的蛋白Rpf因子以分泌的形式被表達,而且其分子量約為20kDa,同預計的目的蛋白大小相吻合。經凝膠薄層掃描檢測蛋白含量,結果表明重組pPIC-Rpf酵母轉化子表達的Rpf因子約占總分泌蛋白量的35%。

為了得到大量的Rpf因子,將篩選得到的高表達菌株通過5L貝朗發酵罐誘導表達,能夠獲得大量的具有較高生物活性的Rpf因子。

4、表達產物Rpf因子的分離純化

發酵結束后,將發酵液4000r/min離心30min,收集上清液。上清液用300K超濾膜超濾,收集濾過液,300K濾膜可以除去發酵液中的大分子的核酸和蛋白。收集濾過液再用5K濾膜將濾過液,體積濃縮至發酵液體積的1/5。發酵過程中培養基加入了部分無機鹽,為了對下一步純化減少影響,使用G25除掉發酵液中殘留的金屬離子。

將濃縮后的發酵液進行Sephadex-G25柱除鹽:用10倍柱體積的10mmol/L、pH8.0的磷酸緩沖液平衡Sephadex-G25柱后上樣,上樣量為柱體積的1/3,然后用相同緩沖液淋洗,收集包含Rpf因子主峰的粗純化洗脫液(第一個洗脫峰);

將粗純化洗脫液用PEG20000進一步濃縮,透析后上樣于平衡的DEAESepharose?Fast?Flow陰離子交換層析柱,用含0~1mol/L?NaCl的pH?8.0、20mmol/L?Tris-HCl洗脫目的蛋白,收集主蛋白峰。

5、表達產物Rpf因子的Western-blot鑒定

將收集純化的Rpf蛋白與抗Rpf的單克隆抗體(由第四軍醫大學附屬西京醫院臨床檢驗科樊愛林博士饋贈)做免疫印跡檢測,化學發光法顯色。結果如圖7所示,其中,泳道M為蛋白標準分子量Maker,泳道1在相對分子量為20kDa處有一條帶,表明純化的Rpf因子含有能與Rpf單抗特異性相結合的表位。

6、純化產物Rpf因子對恥垢休眠菌的復蘇和促生長作用

參照Wayne[Wayne?LG.Dormancy?of?Mycobacterium?tuberculosis?andlatency?of?disease.Eur?J?Clin?Microbiol?Infect?Dis,1994,13(11):908-914.]報道的方法,將乏氧休眠狀態的恥垢分支桿菌以1∶100比例接種到含有10pM、100pM、1000pM?Rpf因子的LB液體培養基中,同時以不含Rpf因子的培養作為對照;每隔4小時測定培養液的OD600值,連續測定44小時,根據測定結果繪制生長曲線,結果如圖8所示:

橫坐標為檢測的時間(h),縱坐標為表示菌含量的OD600檢測值,與對照相比,可以看出Rpf蛋白能夠促進恥垢休眠菌的復蘇和生長,濃度在100pM時復蘇作用明顯,且與1000pM無顯著差別。

7、Rpf對MTB?H37Ra的復蘇和促生長作用

取羅氏培養基中保存的MTB?H37Ra株接種到Sauton’S培養基中,37℃密封培養2個月備后,取100μL轉接到5mL?7H9培養基中,加入不同濃度(10pM、100pM、1000pM)Rpf,37℃條件下培養40天,同時以添加PBS的7H9培養基培養作為對照,每5天測定培養液的OD600值,根據測定結果繪制生長曲線,結果如圖9所示:

橫坐標為檢測的時間(d),縱坐標為表示細菌含量的OD600檢測值,與對照相比,很明顯可以看出Rpf因子能夠促進MTB?H37Ra的復蘇和生長;當Rpf因子濃度為100pmol/L時,刺激的MTB復蘇和生長作用明顯,且與1000pmol/L無顯著差別。

8、Rpf因子對臨床痰標本中MTB促生長作用

收集痰涂片陽性的TB臨床患者標本,用2%NaOH和N-乙酰-L-半胱氨酸消化去污法處理;加入不同濃度(10pM、100pM、1000pM)Rpf,37℃條件下在Sauton’S培養基中培養,同時以添加PBS的Sauton’S培養基培養作為對照,每5天測定培養液的OD600值(連續觀察40天),繪制生長曲線,觀察Rpf因子對臨床標本分離的MTB促生長作用;結果如圖10所示:

橫坐標為檢測的時間(d),縱坐標為表示菌含量的OD600檢測值,與對照相比,可以看出Rpf因子能夠促進臨床標本中MTB的生長;當Rpf因子濃度為100pmol/L時,刺激MTB臨床標本復蘇和生長作用明顯,且與1000pM無顯著差別。在已完成的40例病人標本檢測中,當培養基中加入Rpf因子后其培養時間比常規方法平均縮短一周以上,這樣就縮短了TB診斷中分離、培養MTB的時間,有利于TB的簡便、快速鑒定。

核苷酸序列表

<110>中國人民解放軍第四軍醫大學

<120>一種基于酵母表達系統的分泌型Rpf因子的制備方法及其應用

<160>1

<210>1

<211>672

<212>DNA

<213>藤黃微球菌(M.luteus)

<400>1

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atcgtcgcgg?gcatgaccct?cgccggcgcc?gccgccgtgg?gcttctccgc?cccggcccag????120

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一種 基于 轉化 分泌 Rpf 因子 制備 方法 及其 應用
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